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Um die In-vivo-Rolle von Kti12 und seine ATPase-Aktivität besser zu verstehen, analysierten wir Hefestämme, die Mutationen in der Nukleotidbindungstasche von ScKti12 entsprechend Cti12 tragen (Abbildung 3A). Erstens isolierten wir Bulk-tRNAs von diesen Stämmen und verwendeten Massenspektrometrie (LC–MS/MS), um Elongator-abhängige tRNA-Modifikationen quantitativ zu profilieren. Stark reduzierte Konzentrationen der U34-Modifikationstypen ncm5U, mcm5U und mcm5s2U wurden in kti12-Zellen und in kti12-Mutanten beobachtet, die katalytisch defekte Kti12-Proteine exdrückten (Abbildung 3B), nämlich K14A und T15A (Abbildung 5A). Darüber hinaus akkumulieren diese Mutanten s2U, eine abnormale Thio-Modifikation, die in tRNAs nicht aus der Typ KTI12 oder der T16A-Mutation (Abbildung 5A) und typisch für Elongator-Mutationen (4,79) nachgewiesen wurde, wenn vollständige U34-Modifikationen nicht durchgeführt werden können. Bei T16A, D85A (analog zu D129A in CtKti12) und D85A/T15A mit intakter ATPase-Aktivität (Abbildung 3B) waren die Modifikationen ncm5U, mcm5U und mcm5s2U nachweisbar, wenn auch in mäßig abgesenktem Niveau im Vergleich zum Wildtyp (Abbildung 5A). Überraschenderweise zeigte keines der gereinigten Kti12-Proteine eine basale ATPase-Aktivität in vitro (Abbildung 2B). Um den Mechanismus der Kti12-Aktion zu verstehen, haben wir gefragt, ob Kti12 einen Cofaktor benötigt, um seine ATPase-Funktion zu aktivieren. Daher wurden Kti12-Proteine mit ATP und Magnesium in Gegenwart von Bulk-tRNAs aus verschiedenen Hefestämmen oder verschiedenen gereinigten in vitro transkribierten tRNA-Arten, die CCA-Schwänze enthalten (z. B. tRNAGlu, tRNASer und tRNASec), inkubiert.

Analog zu PSTK zeigten sowohl ScKti12 als auch CtKti12 eine signifikante Upregulation der ATPase-Aktivität bei der Behandlung mit in vitro transkribierten tRNASec (Abbildung 2C und Zusatzabbildung S3B,C,D). Die beobachtete ATP-Hydrolyserate von Kti12 in Gegenwart von tRNASec (kcat = 1,59 x 10 x 3 s 1) ist 100 % schneller als die Aktivierungsrate des archaealen MjPSTK (70). Da weder eine der anderen tRNA-Proben noch PolyU-RNA oder die Antikodon-Stammschleife von tRNASec die ATPase-Aktivität von Kti12 induzieren, scheint der zugrunde liegende Mechanismus sehr spezifisch zu sein (Abbildung 2C). Darüber hinaus verwendeten wir MANT-markierte Nukleotide, um die Bindungskonstanten von ATP (KD -1,0 -M) und AMPPNP (KD – 8,6 M) bis ChKti12 zu bestimmen (Abbildung 2D und Zusatzabbildung S3E). Wir haben keine Veränderungen in der Affinität zu den Nukleotiden in Gegenwart von tRNASec beobachtet, was zeigt, dass tRNA die Aktivität nicht ankurbelt, indem die Rate der ATP-Bindung erhöht wird (Abbildung 2D). Der eukaryotische Elongator-Komplex (Elp1-Elp6) wurde ursprünglich aus Hefe in Verbindung mit aktiv transkribierender RNA-Polymerase II (1) isoliert und damit in die Transkriptionsdehnung (2) involviert. Bis heute deutet jedoch eine solide wissenschaftliche Beweislage darauf hin, dass die Hauptrolle von Elongator in seiner tRNA-Modifikationsaktivität (3–5) liegt. Dementsprechend bindet Elongator tRNAs mit verschiedenen Untereinheiten (6–8) und stellt das zentrale Element eines konservierten tRNA-Modifikationswegs dar, der funktionell zwischen eukaryotischen Organismen austauschbar ist (4,5,9).

Im Detail befestigt der Elongator-Komplex Carboxymethylgruppen (cm5) an Uridinbasen, die sich in der Wackelstellung (U34) von tRNA-Antikodons befinden. Diese zentrale Substitution kann durch andere Modifikationskadude (4,10) weiter in 5-Carbamoyl-Methyl (ncm5), 5-Methoxy-Carbamoyl-Methyl (mcm5) umgewandelt werden. Vor allem aber bedeutet die Entfernung von Sand, dass es verhindert wird, sich in Lagertanks und Fermentern als Sediment anzusammeln. Dadurch wird ein erheblicher Platzfreiraum frei, die Biogasproduktion optimiert und kostspielige Wartungsstopps für die manuelle Reinigung von Tanks und Fermentern verhindert.

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